Sydney erwacht in Tokio in einem Haus der CIA. Erschrocken stellt sie fest, dass zwei Jahre vergangen sind und sie sich an diese Zeit nicht erinnern kann. Als Sydney in die USA zurückkehrt, ist nichts mehr wie es war: Ihr ehemaliger Gegenspieler Sloane leitet eine humanitäre Hilfsorganisation und ihr Freund Vaughn hat eine andere Frau geheiratet.
Eine Gruppe russischer Nationalisten - The Covenant - hat zwei CIA-Agenten entführt. Die Kidnapper töten die eine Geisel und verlangen Sark im Tausch gegen die zweite. Sydney ist dagegen, aber Lindsey glaubt, dass Sark keine Geheimnisse mehr hat und entbehrlich ist. Der Austausch wird von einem von Lindsey georderten Helikopter gestört. In dem Chaos werden Sark und der Agent entführt. Es stellt sich heraus, dass Sark offenbar der Sohn von Lazarey ist, der wiederum ein Nachfahre der Romanows sein soll. Jack ist daher überzeugt, dass The Covenant auch hinter Syds Verschwinden steckt und sie gezwungen hat, Lazarey zu töten...
Endlich sind Sydney und Vaughn wieder als Team vereint. Nun wollen sie Sark daran hindern, das nationale Satellitensystem zu zerstören. Jack dagegen muss Marshall davon abhalten, die Identität eines Mörders aufzudecken. Dadurch könnte Sydney in Schwierigkeiten geraten. Vaughn und seine Frau Lauren treffen sich unterdessen mit Sloane, um ihn um einen Gefallen zu bitten.
Bei einem Einbruch wurden Ebola-Viren aus einem Labor gestohlen. Dahinter steckt eine Gruppe, die eine neuartige Biowaffe herstellen will. Da bei dem Einbruch einer der Verbrecher mit dem Virus infiziert wurde, soll Sydney als dessen Ersatz in die Gruppe eingeschleust werden, um bei dem nächsten Einbruch die Beute mit einem Peilsender zu versehen - doch der Anführer der Gruppe scheint Sydney aus früheren Zeiten zu kennen, denn er hält sie für seine Geliebte...
Sydney bangt um Vaughns Leben, denn bei ihrem letzten Auftrag musste sie ihn niederstechen, um nicht aufzufliegen. Inzwischen hat Simon, der Anführer einer Verbrechergruppe, seine neuartige Biowaffe bereits verkauft. Der Supervirus kommt kurz darauf zum Einsatz, als der "Konvent" die Viren in einem Gefängnis freilässt. Wie geplant überlebt nur der Waffenhändler Bomani, der sich nun an Sloane rächen will, weil dieser ihn damals hinter Gitter gebracht hat...
Robert Lange hat eine Art Schlüssel zum russischen Nuklearwaffenarsenal erfunden und wird nun gejagt. Er hat den Chip in einem seiner Zähne versteckt, den ihm die wieder aufgetauchte Allison prompt zieht. Allison, die für den so genannten Konvent arbeitet, wird bei der Flucht von Sydney überrascht und angeschossen. Lauren sucht weiterhin nach der Mörderin von Lazarey. Die Spur einer Audiodatei führt sie in ein Londoner Büro, welches eine gewisse Julia Thorne gemietet hat.
Sydney wird verfolgt: von wirren Albträumen und Agenten aus den eigenen Reihen. Die Spur ihrer Träume führt sie in eine Wohnung in Rom, in der sie untertauchen kann. Trotz Jacks Bemühungen, seine Tochter zu schützen, ahnt Lauren längst, dass Sydney in den Mord an Lazarey verwickelt ist. Nun kann sie ihren Verdacht bestätigen und informiert Lindsey vom Sicherheitsrat. Gerade als Sydney den Ursprung ihrer Albträume auflösen kann, wird sie von Agenten verhaftet.
Sydney wird in einer Haftanlage des Sicherheitsrats festgehalten und grausam gefoltert, da sie nicht kooperieren will. Doch es gelingt Lindsey, Sydneys Schale zu knacken. Er zwingt sie, einen Text aus der Wohnung in Rom zu dechiffrieren. Lindsey ahnt jedoch nicht, dass sie ihm falsche Koordinaten nennt. In der Zwischenzeit tüfteln Jack, Vaughn und Sloane zusammen mit Lauren an einem Plan, um Sydney aus der Anlage zu befreien. Es kommt zum Schusswechsel.
Nachdem Sydney in der Wüste eine erschreckende Entdeckung gemacht hat, erklärt sie sich bereit, sich einem Experiment zu unterziehen, bei dem ein exzentrischer Arzt versuchen wird, ihre verloren gegangen Erinnerungen zurückzuholen. Unter den Augen von Jack und Vaughn wird ziemlich schnell klar, dass man so einfach an die Erinnerungen nicht kommen kann - und es könnte sie umbringen, wenn man das Experiment weiterführt. Lauren bringt ein großes Opfer, damit sie ein Alibi gegenüber Lindsey vorweisen kann, nachdem sie Sydney aus der NSC Gefangenschaft befreit hat. Sloane wird von einem unerwarteten Feind in die Enge getrieben - jemand der gerne Sydney Bristow ein für allemal ausgeschaltet wissen möchte.
Nachdem Sydney den verblüfften Will aus dem Zeugenschutzprogramm geholt hat, befinden sich die beiden auf der Flucht vor ihren Verfolgern. Dabei stoßen sie ausgerechnet auf Allison, die ihr beider Leben zerstört hat. Sloane wird immer noch von Lindsey unter Druck gesetzt und soll Sydney umbringen. Währenddessen dreht die eifersüchtige Lauren durch und nimmt sowohl Jack als auch ihren Mann Vaughn gefangen.
Ausgerechnet von Kendall erfährt Sydney die Wahrheit über einen Teil der zwei Jahre, die ihr in der Erinnerung fehlen. Der FBI Agent berichtet, dass sie von The Covenant entführt und in Russland gefangen gehalten wurde. Dort habe man sie per Gehirnwäsche zu einer skrupellosen Killerin umerziehen wollen. Doch Sydney habe ihre Verwandlung nur vorgetäuscht und stattdessen Kendall mit Informationen über die Organisation versorgt.
Bei ihrer Suche nach einem russischen Wissenschaftler sind Sydney und Vaughn mit dem Flugzeug in Nordkorea abgestürzt und wurden dort gefangen genommen. Jack setzt alle Hebel in Bewegung, um die beiden zu befreien. Deshalb trifft er sich mit der ehemaligen KGB-Agentin Katya Derevko. Doch die will ihm nur unter einer Bedingung helfen: Jack soll zuerst Sloane töten. - Gaststar: Isabella Rossellini.
Der Konvent-Überläufer bietet Informationen zur Doleac-Agenda, die Namen und Informationen zu Operationen des Konvents enthält. Auf der Suche danach überwinden Vaughn und Sydney ein tödliches Abwehrsystem, während Lauren ihr verräterisches Spiel weiter spielt: Sark will mit ihr die Anführer der sechs Konventzentralen töten, um so selbst eine bessere Position in der Gruppe zu erlangen. Sloane steht kurz davor, der CIA-Psychologin ein Geheimnis über Jack und Sydney anzuvertrauen.
Dixon beauftragt Sydney und Vaughn, von einem Server in Vancouver Daten über eine neuartige Bombe herunter zu laden, die in Kürze an eine Konventzelle in Europa geschickt werden soll. Aber ein Computervirus verhindert einen vollständigen Download. Offenbar hat ein Maulwurf bei der CIA den Konvent über die Aktion informiert. Kurz darauf wird einer der Sicherheitsleute erschossen. Syd und Vaughn verfolgen die Schützen, ohne zu ahnen, dass es sich dabei um Lauren und Sark handelt, die selbst an die Bombe gelangen wollen. Bei der Verschiffung der Bombe kommt es schließlich zum Showdown zwischen den Vieren...
Daniel Ryan ist Bombenbauer. Er bietet dem Konvent eine nicht zu entschärfende Konstruktion an, die die CIA aber vorher abfangen will. Sydney und Vaughn schleusen sich getarnt als Konvent-Mitglieder in ein Flugzeug, um mit Ryan zu verhandeln. Der will sich jedoch hauptsächlich an Sark für den Mord an seinem Bruder rächen. Als er erfährt, dass nicht Sark, sondern Sydney seinen Bruder im Auftrag des Konvents ermordet hat, löst er den Bombencountdown aus...
Sark kann der CIA entkommen und teilt Dixon kurze Zeit später mit, dass der Konvent seine Kinder entführt hat. Wenn Dixon sie wiedersehen will, soll er fünf inhaftierte Konvent-Mitglieder freilassen. Die Doppelagentin Lauren legt die Spur zu Sloane, der nun verdächtigt wird, Sark bei dessen Flucht geholfen und die Kindsentführung initiiert zu haben. Sydney kümmert sich derweil um die wahre Forderung des Konvents: das Rambaldi Artefakt 45, ein Kästchen mit der Inschrift "Irina"...
Die Agenten erfahren, dass Rambaldis Kästchen nur mit einem Schlüssel geöffnet werden kann, zu dessen Versteck eine Karte aus einzelnen Kristallstücken führt. Bevor sie den Schlüssel bergen können, kommt ihnen der Waffenhändler Bomani in die Quere. Jack verdächtigt Lauren, als Maulwurf tätig zu sein. Um nicht aufzufliegen, soll der Verdacht auf ihren Vater, Senator Reed, gelenkt werden. Als man Sloane in Verbindung zum Senator bringt, wird er verhaftet. Ihm droht die Hinrichtung!
Als ein Computer-Wurm von Berlin aus Krankenhäuser und Universitäten angreift, vermutet die CIA, dass der Konvent dahinter steckt und einen Vorläufer von Rambaldis Biowaffe testet. Syd und Vaughn suchen in Berlin nach dem verantwortlichen Hacker, aber Lauren spürt ihn zuerst auf und tötet ihn. Trotzdem kann er Vaughn noch den Quellcode des Wurms übergeben. Syd meint, sie hätte Lauren in dem Club gesehen, aber Vaughn glaubt, dass sie in England ihren Vater beisetzt. Als Lauren klar wird, dass sie ihren Auftrag vermasselt hat, muss sie Vaughn und Syd in Berlin aufsuchen, obwohl sie riskiert, so deren Misstrauen zu wecken. Tatsächlich beginnt nun auch Vaughn langsam an ihr zu zweifeln...
Sark bedroht einen Mönch, der weiß, wo das Manuskript versteckt ist, welches den Aufenthaltsort des Passagiers offenbart. Sydney kommt gerade rechtzeitig, um von dem sterbenden Mönch zu erfahren, dass der Passagier ihre Schwester ist. Vaughn muss sich indessen an die Fersen seiner intrigierenden Frau heften. Sie führt die CIA zu einem Stundenglas, das Sloane den Aufenthaltsort seiner Tochter verraten soll.
Sydney und Vaughn enttarnen Sloanes uneheliche Tochter als den geheimnisvollen Passagier. Um die junge Frau ausfindig zu machen, benötigen sie nun dessen Hilfe. Während der Suche trifft Sydney auf ihre Halbschwester Nadia, eine argentinische Agentin. Kurz nachdem Vaughn ein Geheimnis über seinen Vater erfahren hat, wird er von Lauren und Sark entführt. Die beiden wollen den Passagier zuerst fassen.
Sydney und Vaughn sind immer noch auf der Suche nach Sloane und Nadia. Unterstützung erhalten sie dabei von Katya Derevko und der Sicherheitsexpertin Toni Cummings. Doch Lauren und Sark sind ebenfalls hinter den beiden her. Gleichzeitig ist Vaughn mittlerweile davon besessen, seine Frau Lauren zur Strecke zu bringen.
Nachdem sich Lauren als Sydney verkleidet die Rambaldi-Gleichung aus dem CIA-Computer herunter geladen hat und auf Marshall geschossen hat, wird Sydney von der Spionageabwehr verdächtig, in den Vorfall verwickelt zu sein. Daher wird sie vorerst aus dem aktiven Dienst genommen. Vaughn ist fest entschlossen, sich für Laurens Verrat zu rächen und sie zu töten. Als er sie aufspürt, kommt es zwischen den beiden zum Kampf. Doch als Vaughn die Oberhand zu gewinnen scheint, wird er plötzlich von hinten bewusstlos geschlagen...